샘플도 겔도 다 만들어놨으면 이제 런닝해서 단백질을 크기별로 분리해야 한다!
이 사진은 마지막 단계에서 membrane을 detection한 사진이다.
저렇게 단백질이 kDa 에 따라서 분리된다.
Acrylamide의 pore size에 따라서
크기별로 분리되니까
작은 size의 단백질을 확인하기 위해서는 낮은 %의 Acrylamide gel을 만들어야하고
큰 size의 단백질을 확인하기 위해서는 높은 %의 Acrylamide gel을 만들어야 한다!
무튼, 나는 약 25kDa의 단백질을 확인하려고 했기 때문에
10% Acrylamide gel을 만들었다.
자, 이제 Running, Separate을 시작해보자!
① Separate
파워서플라이, 겔탱크, 런닝 틀을 준비한다.
그 다음 런닝틀 안에 Running buffer를 붓는다.
만약 런닝틀이 제대로 꽂히지 않아서 Running buffer가 샌다면
제대로 단백질이 분리되지 않고
Running buffer가 stacking gel 아래로 내려올만큼 샌다면
파워가 꺼지면서 단백질 분리가 멈추니까 제대로 고정해준다.
새지 않는 것을 확인 하면 겔 탱크에 Running buffer를 채워준다.
만약 바이오라드 제품을 쓴다면 gel 개수에 따라서 Running buffer를 부어야하는 양이
탱크에 표시되어 있으므로
그 표시를 확인해 보고 겔 개수에 맞춰서 부어준다!
(2개면 절반정도, 4개면 가득 부어줌)
그리고 gel안의 comb에 마커와 샘플을 넣어준다.
마커는 5ul 정도 넣어줘도 충분하고 샘플은 만들어 놓은 양 전부 넣는다.
그리고 voltage를 조절해서 Running 시작!
stacking gel에서 달릴 때와 Running gel에서 달릴 때의 Voltage 값은 다른데
그건 랩바랩이므로 잘 조절해서 런닝한다.
② Transfer
샘플을 나타내는 파란 부분이 gel 밑까지 내려올 정도로 어느 정도 내려왔으면
Transfer를 준비한다.
먼저 Transfer 할 membrane을 gel 크기대로 자른다음
메탄올에 담가서 5분 정도 activation 시킨다.
그 다음 파워서플라이를 스톱하고 트레이에 Transfer buffer를 부어준다.
트랜스퍼를 위해서 층층히 필요한 물품을 순서에 맞게 올리고
잠근 다음 트랜스퍼 틀에 맞춰 끼워 트랜스퍼 한다.
트랜스퍼가 끝나면 gel에 있던 단백질이 membrane으로 옮겨 붙었을 것이다.
잘 붙어있을 수 있도록 Skim milk in TBS-T로 1시간 정도 Blocking 해준다.
blocking 이 끝나면 내가 보고자 하는 단백질 크기에 맞게 membrane을 자른다.
여기에서부터 이제 위아래가 아주 중요하다.
한 샘플에서 보고자 하는 단백질이 2개 이상이면
그 크기에 따라서 마커로 기준을 잡아 membrane을 잘라서 확인하는데
만약 마커가 몇 kDa 인지 모르게 표시를 해놓지 않으면
어떤 단백질인지 잊어버리기 쉽기 때문에
붙여야할 antibody도 헷갈려버리기 때문이다.
그렇게 되면 시간이면 샘플, 안티바디까지 전부 날리게 된다 ㅠㅠ
완전 아까워 ㅠㅠㅠ 심지어 안티바디는 비싸서 소량구매에 재사용도 하고
배송시간마저 2주정도 걸려서 정말 시간적으로 제약이 크다.
근데 내가 멤브레인 확인 안 해서 날린다면....
빨리 결과내야하는 직장인 연구원으로써는 손해가 크다 ㅠㅠ
무튼, 그래서 나는 membrane을 맞춰서 자른다음
내가 보고자 하는 단백질 이름을 샘플이 걸려있지 않은 membrane 끝쪽에 적어둔다.
수성펜 말고 볼펜? 그런걸로 적으면 번지지 않는다!
이렇게 membrane으로 protein을 옮겨놓았으면 거의 끝났다!!
antibody로 detection만 하면 끝!!
antibody detection 방법은 또 추후에 배워보자!!!
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