[실험] 중합효소연쇄반응, PCR이란?? DNA RNA Gene work 의 기초!!

생명과학 분야의 고인물이라면

 

눈 감고 몇 백판 돌리는거야 식은 죽 먹기인,

 

일단 한 번 시작하면

 

그 다음부터는 24시간을 칼같이 쪼개서 쓸 수 있는 능력이 생기는

 

이름하야 PCR 되시겠다.

 

PCR. 출처_https://mrleehamberbio12.wordpress.com/pcr-cycle-amplification/

 

 

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PCR이란?

 

풀네임은  Polymerase Chain Reaction, 중합효소연쇄반응이다.

 

내가 보고자 하는 DNA region을 복제, 증폭시키는 분자생물학적 기술로

 

아주아주 기본적인 실험이다.

 

 

PCR은 아주 미량의 DNA용액에서 원하는 부분만

 

DNA 단편으로 만들어

선택적으로 증폭시킬 수 있고

 

원하는 만큼 증폭시키는데에 2시간 정도? 밖에 안 걸리기도 하면서

 

실험 방법이 너무나도 단순하다.

 

요새 기기들도 너무 잘 나오고 키트도 잘 나오기 때문에 

 

진짜 발로 해도 DNA 밴드 짱짱하게 보인다.

 

(근데 안 나오는건 죽어도 안 나옴)

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PCR 진행 단계는 3가지 인데

 

변성(Deneturation), 결합(Annealing), 신장(Extension)으로 이뤄져 있다.

 

아래에 설명한 PCR법은 가장 기본적인 PCR법이다.

 

PCR도 목적에 따라서 굉장히 다양한 종류를 가진다.

 

기계도 키트도 천차만별이다!!

 

 

PCR step. 출처_the biology note

 

일단 PCR을 하기 위해서는 위 그림에 나와있는 것 처럼

 

DNA sample, Primer, Nucleotides, Taq polymerase, buffer 등이 필요하다.

 

(옛날엔 이거 다 하나하나 만들어서 썼다는데 ㅎㄷㄷ

요새는 키트 잘~~~~ 나온다 !!)

 

Deneturation단계에서는

 

이중가닥인 DNA를 가열해서 분리함으로써

 

각각의 한 가닥으로 분리되는데, 이를 통해서 이제 각 가닥들이

 

하나의 주형가닥(Template)으로써의 역할을 하게 되는 것이다.

 

Deneturation 할 때 일반적인 온도는 95도이다.

 

이 온도는 DNA내에 있는 GC contents양과 보고자하는 DNA length에 따라 다르다.

 

높은 온도일수록 단일가닥으로 분리가 잘 되지만

 

Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 변성될 수 있는 위험이 있기 때문에

 

보통 94~95도로 한다.

 

Annealing단계가 PCR에서는 가장 중요하다.

(사실 안 중요한 건 없다!)

 

한 가닥으로 분리된 Template에 Primer가 결합하는 단계다.

 

기본적으로는 50~65도에서 진행되는데

 

이것도 마찬가지로

 

Primer의 GC contents양과 보고자하는 DNA length에 따라 다르다.

(Primer design 하는 방법이 정말 중요한데, 이는 추후에 자세히 알아보자!!)

 

Primer가 Template의 상보서열에 결합한다.

 

Primer가 Template에 결합하면

 

DNA의 5`->3`방향으로 합성이 시작된다.

 

마지막 Extension! 

 

Primer가 붙었으니 이제 열심히 DNA를 복제하기 시작한다.

 

내가 원하는 부위가 쭉쭉 만들어지고 있는 단계다.

 

Taq polymerase는 보통 1분에 2~4kb를 중합시킬 수 있으므로

 

원하는 PCR product의 1kb마다 1분 정도 시간을 주면 충분하다.

(그래서 product length짧으면 시간 줄인다. 빨리 끝내자~!)

 

보통 이 과정을 20~40번 반복진행하고

 

원하는 부분이 잘 증폭됐는지 확인하는 마지막 단계를 거친다.

 

Agarose gel electrophoresis, 아가로스겔 전기영동으로 그 크기를 확인한다.

 

 

어우 밴드 짱짱하게 이쁜거 좀 봐 ♡ 출처_https://www.jove.com/t/3923?

 

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PCR을 시작하면 DNA work은 순차적으로 술술 풀리게 된다.

 

왜냐하면 PCR을 위해서는

 

원하는 DNA region을 찾아야되고, Primer design 해야 하고

 

샘플에 맞는 PCR kit 선정해야하고 PCR기계 선정해야 하고

 

나중에 전기영동으로 밴드 봤을 때 잘 안나오면 트러블 슈팅 해보고 다시 primer 디자인 하고

 

잘 나오면 Purification 해서 Sequencing 보내보고

 

Sequencing 잘 나오면 이제 Transformation해보고 Crispr-cas9 등등 

 

유전자 조작까지

 

가장 기본적이지만 DNA분야의 초석이며 필수적인 개념이므로

 

하나만 완벽히 이해하면 그 뒤로는 술술 따라오게 되어 있다.

 

 

난 그래서 DNA work, Gene work이 너무 재밌다 ♡

 

내 샘플 얼굴 보는거 진짜 최고야 짜릿해 언제나 새로워!!!!!