[실험] BCA assay 로 단백질 정량을 해보자!! 튀지 마 내 O.D 값~~~

내가 맨 처음 BCA assay를 접했던 건 melanin assay를 하기 위해서였다.

 

B16F10, melanocyte를 이용한 미백실험을 하고 있었는데,

 

멜라닌을 끊임없이 생성하는 세포로

 

내가 처리하는 미백 물질에 따라서 

 

단백질, 그러니까 멜라닌이 얼마나 줄어드는지를 확인하기 위해서

 

BCA assay를 사용했었다.

 

BCA! 출처_OneLab

BCA는 정말 다양한 실험에서 쓰인다.

 

아무래도 protein을 정량하는 가장 간단한 실험이다보니

 

protein, 단백질을 다루는 실험에서는 필수적으로 포함된다.

 

물론 BCA가 아닌 다른 실험들도 많지만!

 

되게 간단하고 시간도 얼마 안 걸려서 가장 일반적으로 쓰이는 실험법이다.

 

BCA는 Bicinchoninic acid의 줄임말로 시약이름이다.

 

어떤 단백질 종류라도 정량할 수 있고 0에서 2mg/ml 까지 정량 가능하다.

(이 범위는 엄청 넓은 범위다!!)

 

얘네는 계면활성제에 의한 영향을 받지는 않는다.

 

하지만 킬레이트계 물질이나 환원제는 반응성에 영향을 주니까

 

얘네들이 포함된 용액의 정량에는 적합하진 않다.

 

 

하다보니 BCA는 너무 간단해서 실험이라고도 안 한다..

 

그냥 BCA는 BCA일 뿐

 

(누가 대신 좀 해 주실 분? 계산까지 부탁해용~~)

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BCA 단백질 정량의 원리는 무엇일까?

 

먼저 약 염기성을 띠는 용액 내에서 정량하려는 단백질의 펩타이드 결합에 의해서

 

뷰렛반응이 진행된다.

 

Cu+2가 Cu+1로 환원되는 것이다.

 

이 때 환원되는 Cu+1의 양은 용액에 들어있는 단백질의 양과 비례한다.

 

그 다음, BCA용액이 환원된 Cu+1과 배위결합해서

 

파란색~보라색의 화합물을 형성한다.

 

이 때 spectrophotometer, 분광광도계로 540nm 쯔음에서 찍으면

 

값이 쫙 나온다.

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내 프로토콜은 

 

Pierce™ BCA Protein Assay Kit의 가이드라인을 따른다.

(cat no : 23225, 광고 아님 ㅋㅋㅋㅋ)

96well에 sample을 10ul 씩 넣는다.

 

샘플 로스 없도록 조심해서 잘 넣어야하고, 혹시 모르니 듀플리, 트리플로 샘플 걸어준다.

 

이때 sample 희석배수는 알아서 잘 컨트롤 한다.

 

스탠다드로 잡는 Albumin의 최고 농도가 2mg/ml이므로

 

이 농도가 넘지 않을 정도로 희석해주면 된다.

 

ELISA관련 포스팅에서도 언급했다시피, 스탠다드커브 값 위아래로 측정값이 나가버리면

 

결과가 흔들린다 ㅠㅠ

 

그 다음, reagent A와 B를 50 : 1 비율로 섞어준 다음

 

각 well에 80ul 씩 넣는다.

 

sample 양이 많으면 멀티 파이펫 필수다. ㅠㅠ

 

우리 랩에 처음에 멀티 파이펫이 없어서 진짜 고생고생을 했다 ㅠㅠ

 

96well plate 두판 찍어야 되는데 무슨 이백번 넣어줘야하는데

 

처음에 넣었던 건 색깔 점점 변하고 있고.... 이런 ㅠㅠ

 

멀티로 하면 금방인데!!!! ㅠㅠㅠㅠㅠㅠ

 

그 때 부장님 불러와서 반대쪽꺼 넣어달라고 부탁했던 기억이... ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

 

아무튼!!!!

 

다 처리한 후에 oven, 56도에서 10분 처리 후에 바로 찍는다!!

 

스탠다드커브는 한 번 그려놓고 계속 그걸로 정량하는 실험자들도 있긴 하던데

 

나는 그냥 할 때마다 매번 다시 그린다.

 

농도랑 OD값으로 스탠다드 커브 그린다음

 

R제곱 값이 0.99 이상이면 PASS!!!!

 

단위는 스탠다드 그렸던 친구의 단위를 따른다. mg/ml!!!

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spectrophotometer로 찍을 때는 거품이 생기면 안된다.

 

레이저로 찍는거기 때문에 거품이 있으면 빛이 굴절되서

 

값이 엄청 튄다.

 

거품이 생기면 파이펫으로 터트려주면 되는데

 

그러면 샘플 로스 생겨서 단백질 정량값이 흔들릴 수 있다.

 

그 때는 스퀴즈보틀에 알코올을 채우고 

 

안에 있는 관을 뽑아서

 

알콜바람을 거품 생긴 웰 위에 불어주면 거품이 쉽게 꺼진다.

 

깨알 꿀팁!!!!!!!!! 아무도 알려주지 않는 고인물 만의 진정한 꿀팁

 

ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

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무튼, 이렇게 간단한 조작같은 실험이지만

 

모든 실험의 기초가 되기 때문에 조심조심해서 실험하도록 한다.

 

이 포스팅 읽는 모두들~ 튀지 않는 OD 값 얻었으면 좋겠다. ♡