[실험] Exosome 을 추출해보자! Extracellular vesicle이 뭘까?

세포들은 각자의 기능이 있다.

 

그 기능을 하기 위해서 그 기능을 하는 여러 단백질을 분비한다.

 

그 단백질을 분비할 때 Extracellular vesicle을 이용한다.

 

Extracellular vesicle 모식도. 출처_https://www.onlinejacc.org/content/71/2/193

세포들이 기능하려면 먼저 central dogma를 통해서 단백질 합성을 하고

 

그 단백질이 바깥으로 나가 돌아다니면서 기능을 하는 것인데,

 

세포가 단백질을 뱉어낼 때 사용하는 것이 바로 Extracellular vesicle인 것이다.

 

이들은 돌아다니면서 세포간 신호전달물질로써도 기능할 수 있다.

 

그럼 Extracellular vesicle에 대해 공부를 해보고, 그 중 Exosome 추출법에 대해서도 알아보자!

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세포는 다양한 크기의 지질막 이중층으로 싸인 Extracellular vesicle를 분비한다.

 

그 크기에 따라 종류를 구별하는데,

 

30~200nm의 크기는 Exosome,

 

200~1000nm의 크기는 Microvesicle,

 

1~10um의 크기는 Large oncosome으로 분류한다.

 

이 중에서 Exosome과 Microvesicle로 다양한 연구를 하고 있다.

 

 

Exosome 내부에는 분비하는 세포의 기능과 비슷한 기능을 할 수 있는

 

mRNA, miRNA 같은 다양한 물질들이 들어있다.

 

그러니까, 면역세포가 분비하는 Exosome은

 

면역세포가 분비하는 단백질이 들어있기 때문에 면역세포와 비슷한 기능을 할 수 있다는 것이다. 

 

Exosome에는 이들을 detection할 수 있는 표면 marker들이 있어서

 

분리한 후에 FACS로 간단하게 확인할 수 있다.

 

 

Exosome은 정상상태에서는 많이 분비되진 않지만

 

자극을 받거나 활성상태일 때 분비량이 증가한다.

 

최근 각광받고 있는 세포치료와 마찬가지로 이들도 또 하나의 치료제로써 효능검증을 하고 있는데,

 

세포치료와 비교하여 Exosome의 장점은 다음과 같다.

 

1. 세포치료제와 비교했을 때 비교적 안정적이다.

 

Exosome은 활성을 유지하면서도 동결 건조 등 극한의 환경을 견딜 수 있다.

 

2. Exosome 공여자와 관계없이 다양한 종(species)에 투여가 가능하고 활성을 나타낸다.

 

3. 전신 전달 후 효과적이며,

 

4. 효능 향상을 위해 유전공학적인 접근법에 제한이 없다.

 

 

이렇게 다양한 장점에도 불구하고 Exosome 개발이 난항을 겪고 있는 이유는,

 

분리 방법이 간단하지 않고, 추출량이 미량이며

 

그에 대한 효능 검증이 아직 부족하기 때문이다.

 

 

자, 그러면 Exosome 연구를 위해서 Exosoma 분리를 해보자!!

 

지금 우리랩에서는 베크만에서 Exosome을 분리하는 방법을 따르고 있는데

 

한 번 살펴보도록 하자!

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1. Exosome-Depleted Media의 제작이 필수!

 

내가 원하는 세포의 Exosome을 추출하기 위해서

 

세포가 배양되는 media에 들어있는 Exosome을 전부 제거해줘야 한다.

 

Media에는 세포를 배양하기 위해서 다양한 단백질이 첨가되어 있기 때문에

 

초고속, ultracentrifuge를 통해 제거해준다.

 

거의 120,000xg 로, 4℃로 18시간동안 cfg해야 한다.

 

특히 FBS라고 하는 혈장물질이 들어가는데,

 

여기에는 정말 다양한 Exosome이 포함되어 있으므로 ultra cfg는 필수적이다.

 

2. Exosome-Depleted Media에 cell을 배양한다.

 

3. Exosome을 분리한다.

 

cell pellet을 제거하고 남아있는 배양액을 0.45um 필터로 필터한 다음,

 

2000xg, 4℃로 20분동안 cfg한다.

 

그 상등액을 가지고 또 한번

 

10,000xg로 30분 cgf한다.

 

또 한 번 상등액을 0.22um 필터로 필터하고

 

100,000xg로 90분 정도 cfg한다.

 

이 번에는 상등액을 버리고 남아있는 pellet을 PBS로 걷어낸다.

 

이렇게 PBS로 녹인 pellet, Exosome을 사용할 때 까지 -20℃ 에서 보관한다.

 

4. Gradient Centrifugation을 통해서 한 번 더 확인한다.

 

아래에 베크만에서 제시하고 있는 Gradient Centrifugation figure를 나타내었다.

출처_베크만

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위의 과정을 통해 높은 순도의 Exosome을 분리한 다음에는

 

이제 Exosome이 제대로 뽑혔는지 확인하는 과정을 거친다.

 

내가 원하는 크기에 맞춰 컷오프하여 제대로 다시 한번 정제하는 방법,

 

FACS를 이용해서 표면마커를 확인하는 방법 등 다양한 방법으로 샘플링한다.

 

이 후 Trisol을 이용하여 Exosome에 존재하는 RNA를 추출하고

 

NGS Library를 제작하거나 small seq sequencing등 분석을 진행한다.

 

이러한 과정을 통해서 Exosome 기반 치료제를 개발하게 되는 것이다.

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Exosome은 추출량도 굉장히 적고 이렇게 분리 방법도 꽤나 까다로워서

 

연구과정이 어렵긴 하다.

 

그래도 아직 많이 개발해나가야 할 단계이므로

 

꾸준한 연구개발을 통해서 새로운 치료제 개발에 힘 쓰고 싶다!!