[실험] 생명과학 고인물이 알려주는 PCR 꿀팁!!

PCR,

 

생명과학을 전공으로 선택하고 대학에 입학하면

 

일반생물학이라는 과목을 1학년 1학기 때 전공필수로 듣는데

 

그 수업 한 두번 정도 나가면 바로 나오는 단어가 PCR이다.

 

시험에도 이거 원리 적는거 나오고

 

실험수업에서도 이거 원리 적는거 나오고

 

하여튼 polymerase chain reaction 이거이거 정말 질리도록 배운다.

 

질리도록 실험하고!!!!

 

출처_Toptipbio

 

PCR할려면 필요한 것들이 여러가지 있는데,

 

PCR기계가 당연히 필요하고,

 

(요새 세상 좋아져서 PCR기계 좋은거 너무 많이 나온다.

 

근데 뭐 원리만 알면 클래식한 기계 써도 결과는 잘 나온다.

 

근데 기계 욕심은 끝이 없다.... 다만 비쌀 뿐.... 좋은거 사주면 실험 결과 잘 나올..... .... ...아니다...ㅋㅋㅋㅋ)

 

PCR premix kit 가 필요하고,

 

(또 요새 세상 좋아져서 kit도 너무 좋은거 많다.

 

옛날에는 진짜 뭐 polymerase부터 dye, 각종의 염들까지

 

전부 다 직접 넣어줬다는데, 나는 premix로만 실험 했다. 그래서 넣어주는건 물밖에 없었음... 휴 다행!!!)

 

primer 가 필요하고, 내가 증폭시킬 DNA가 필요하다.

 

 

PCR을 잘 하려면 신경써야할 것이 몇개 있는데,

 

우선 내가 어떤 목적으로 PCR을 할 것인지 정하고, 그에 맞는 PCR기계를 선정한다.

 

standard PCR을 돌릴거면 그냥 PCR기계있으면 되는데,

 

qPCR이나 qRTPCR할거면 다른 기계써야한다.

 

그리고 PCR premix kit도 premix 마다 감도나 성능이 천차만별인데,

 

나는 내가 증폭시킬 DNA sequence를 확인해보고 그 감도를 결정해서 premix를 선택했다.

 

PCR이 정말 높은 수율로 잘 되지만 그만큼 잡밴드들도 많이 생기는 것도 있고

 

그럭저럭의 수율로 PCR이 되지만 잡밴드는 없는 그런 등등의 기능이 천차만별이다.

 

그리고 마지막으로 primer인데,

 

일반적으로 사용하는 Universal primer를 쓴다면 

 

뭐, 따로 PCR primer design 할 필요 없는데

 

specific primer를 쓴다면 이제 design 들어가야 한다.

 

내가 보고자 하는 gene의 reference sequence를 NCBI에서 찾은 다음에

 

pasta를 다운로드 받아서 내가 원하는 부위의 앞뒤쪽 100~200bp 즈음으로 primer region을 선정해서 design 한다.

 

왜냐하면 만약 내가 증폭한 그 DNA를 sequencing 을 맡긴다면

 

sequencing data가 primer binding region의 앞 뒤쪽 100bp 정도는 로스된다.

 

sequencing자체가 불가능하다 ㅜㅜ 

 

그래서 primer 근처 부위를 읽으려면 그 중간에서 다시 primer를 design 해서 반대로 읽어줘야 한다는 귀찮음이 생겨버린다 ㅠ

 

아무튼 그런 일 없도록 처음부터 약간의 공간을 남겨두고 primer 를 짠다.

 

혹시 plasmid 에 cloning 해서 plasmid DNA로 sequencing 보낼거면

 

50~100bp 로 디자인 해도 문제는 없다.

 

일반적으로 plasmid DNA읽을 땐 또 plasmid에 있는 universal primer로 읽는 경우가 많아서

 

PCR했던 걸로 sequencing 잘 안한다.

 

아무튼, 그렇고

 

primer design 할 때는 약 한 18~22mer로 하는 걸 추천하고,

 

Tm값도 한 50~55도로 맞춰주면 좋다.

 

또 primer design할 때 겹치는 부분 있나 없나 필수적으로 확인하고,

 

꼭 겹치는 부분이 없는 쪽으로 디자인 해야하며,

 

sequence가 반복되는 부위는 피해서 짠다.

 

그리고 이건 그냥 내가 하는 방법인데,

 

나는 CG로 시작되는 부분에서 primer design 한다.

 

AT로 시작되는 부분보다 더 안정성 있다는 그런 뇌피셜이 있어서..ㅋㅋㅋㅋ

 

실패하기 싫어서 하는 징크스 같은 걸 수도. ㅋㅋㅋㅋ

 

아무튼 !!! 이정도의 꿀팁으로만 primer design 해도 실패 없다.

 

나는 이 방법대로 2년간 PCR 해왔는데 단 한번도 잡밴드 뜬 적 없다!! ㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

 

잡밴드 떠도 다 방법이 있다.

 

그 방법은 나중에 또 배워보도록 하자~~~~