[실험] kit 말고 TRIzol을 이용해서 RNA를 분리해보자!

회사에서 RNA isolation하는데 비싸다고 키트 쓰지말구 TRIzol로 하라구 했다.

 

항상 키트로만 해서 잘 몰라서 찾아보고 올리는 실험 방법!!

 

TRIzol datasheet에도 나와있는 간단한 프로토콜이니 편한 말투로 올리는 점 양해 부탁드립니다!

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TRIzol을 이용하여 RNA isolation 할 때 필요한 물품 리스트

 Homogenizer
 TRIzol
 Isopropanol
 75% ethanol
 RNase free water
 EDTA or SDS solution
 Chloroform
 RNA grade glycogen

 
Lyse sample and separate phases

1. Lyse sample
* Sample 볼륨은 lysis 하려고 사용된 TRIzol 볼륨의 10%를 초과하지 말 것
     V Tissue : 1ml of TRIzol / 50~100mg of tissue 넣고 homogenize
     V Cell grown in monolayer : media 버리고 300~400ul TRIzol/1x10^5~10^7 cell culture dish 에 directly 넣고

         lyse the cell, pipet , homogenize
     V Cell grown in suspension : (TRIzol 넣기 전에 wash 하지 말것, mRNA degradation 됨.) centri 돌려서

        supernatant 버리고 750ul TRIzol / 250ul sample ( 5~10x10^6 cell of animal, plant,

         yeast origin of 1x10^7cell of bacterial origin) 넣고 pipet, homogenize

 

2. (optional) 만약 sample에 fat content가 높으면 lysate를 12000xg, 4~10℃, 5min centrifuge해서 깨끗한 상등액만 새로운 tube로 옮기기

 

3. nucleoprotein complex가 완전히 dissociation 되도록 5min incubation

 

4. 0.2ml chloroform / 1ml TRIzol 넣고 완전히 섞이도록 shaking

 

5. 2~3 min incubation

 

6. 12000xg, 4℃, 15min centrifuge, centri 끝나면 적색, 무색 등 층이 나뉘는데, 무색의 aqueous phase를 새로운 튜브에 옮김. Aqueous phase에 RNA 들어 있음.
     * aqueous phase 옮길 때 interphase나 organic layer 안 옮기게 조심할 것!!

 

Isolate RNA

1. Precipitated the RNA
     A. (optional) 만약 sample 양이 작으면(<106cell or < 10mg of tissue) 5~10ug RNase-free glycogen 첨가하기.       

         Glycogen은 RNA랑 같이 준비되긴 하지만 방해하진 않음
     B. Aqueous phase에 lysis 할 때 넣었던 TRIZol 1ml 당 0.5ml isopropanol 첨가
     C. 4℃, 10min incubation
     D. 12000xg, 4℃, 10min centrifuge 하면 Total RNA가 tube밑에 white gel like pellet으로 추출됨
     E. 상등액 제거

2. Wash the RNA
     A. lysis 할 때 넣었던 TRIZol 1ml 당 1ml 75% ethanol 첨가
        * 75% ethanol 안에서 -20℃ 보관 시 적어도 1년, 4℃ 보관시 1주 보관 가능
     B. 간단하게 vortex한 다음에 7500xg, 4℃, 5min centrifuge
     C. 상등액 제거
     D. Vacuum or air dry the RNA pellet, 5~10min
        * vacuum centri로 건조하지 말 것, 완벽히 건조하지 않으면 A230/280 ratio<1.6으로 나옴

3. Solubilize the RNA
     A. 20~50ul of RNase free water, 0.1 mM EDTA of 0.5% SDS solution 에다가 섞기.
        * 0.5% SDS안에서 RNA 풀지 말 것, 넣으면 enzymatic reaction 일어남 (이 부분 해석이 잘.. ㅠ)
     B. 55~60℃, 10~15min water bath of heat block에서 incubation
     C. 여기에서 -70℃에서 보관 가능, 아니면 다음 프로세스 진행

4. Determine the RNA yield
     A. Absorbance
     B. Fluorescence
     C. 추후 cDNA synthesis 진행