[실험] Flow cytometry / FACS / 유세포 분석 - ① 기본 원리

Flow cytometry (FCM) 은 유세포분석이라고도 하며

 

세포들의 물리화학적 특성을 검출 및 측정하는데 사용되는 기술이다.

 

 

내가 배양하고 있는 세포가 어떤 세포인지 확인하고 싶을 때 쉽게, 자주 사용되는 기술이다.

 

 

쉽게 풀어서 설명해보면 이런것이다.

 

내가 만약 면역세포를 배양하고 있다면, 

 

그 면역세포 안에는 cytotoxic T cell도 있을 것이고, regulatory T cell도 있고,

 

NK세포도 있고, B세포도 있고 하여간 등등의 다른 여러 면역세포들이 섞여 있을 것이다.

 

이 중에서, NK세포가 얼마나 있는지, regulatory T cell이 얼마나 있는지,

 

cytotoxic T cell이 얼마나 있는지 등을 정량화한 데이터를 낼 수 있는 방법이 유세포 분석, flow cytometry다.

 

그러니까, 특징이 있는 세포들이 섞여 있을 때

 

그 특징을 잘 살려서 세포들을 분리 분석하는 기술인 것이다.

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유세포분석, flow cytometry는 solution, 유액 상태에 있는 입자나 세포가

 

일정 감지 지역, sensing point를 통과할 때

 

각각의 입자나 세포를 신속하게 측정해서 세포의 크기, 세포 내부 조성 정도 등

 

다양한 세포의 특징들을 동시에 측정해서 분리(sorting)하는 기술이다.

 

이렇게 solution 상태에 suspension 되어 있는 입자나 세포를 감지하기 위해서는

 

일정 파장을 가지고 있는 형광이 표지된 항체, antibody로 세포를 염색하거나 표지하는 단계가 필수적이고,

 

이 세포가 유세포분석기를 통과할 때 형광을 감지하는 방법으로는

 

광원인 레이저 광원을 통한 형광의 발광작용을 이용한다.

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유세포 분석기는 크게 세가지의 중요한 부분으로 나뉘어 진다.

 

첫째는 검체를 흡입하는 fluidics, 

 

둘째는 빛의 감지, 즉 광원, 빛의 산란과 형광의 감지, optics,

 

셋째는 signal processing 으로 데이터를 뽑아내는 electronics 과정이다.

 

 

fluidics 는 세포나 입자를 sensing point, 감지지역까지 정확하게 운반하고,

 

운반되는 동안 어떠한 물리적인 영향도 받지 않도록 보호하는 역할을 한다.

 

 

optics에서는 에너지원으로 빛을 이용하는데

 

세포들이나 입자들이 일정 감지지역을 빠르게 지나가기 때문에 빛에는 강한 강도가 있어야하며

 

세포에 붙어있는 형광을 자극하기 위해서는 특정 파장을 가져야 한다.

 

일반적으로 레이저를 사용하는데, 그 레이저가 몇개를 가지고 있느냐에 따라서

 

유세포분석기의 가격이 천차만별로 달라진다.

 

거기다가, 레이저가 많이 달려있으면 많이 달려있을수록 한 번에 측정할 수 있는 antibody갯수가 달라져서

 

많으면 많을수록 좋다.

 

그래도 한번에 그렇게 많은 세포를 측정할 필요가 없는 랩이라면

 

간단하고 관리하기 쉬운 미니사이즈의 유세포분석기만으로도 충분하다.

 

 

레이저를 통과한 입자들은 빛의 산란정도에 따라서 몇가지 parameter로 나뉜다.

 

그 parameter는 총 세가지가 있다.

 

1. Forward Scatter (FSC, 입자의 크기) / 2. Side Scatter (SSC, 입자의 과립, 형태) / 3. Fluorescent (FL, 형광강도)

 

 

유세포분석기에는 2종류의 detector를 이용하는데,

 

Photodiode tube 는 낮은 민감도와 빠른 반응을 인지하므로 정면에서 얻어지는 빛을 감지하여 FSC를 측정하고,

 

Photomultiplier tube는 고감도이지만 제한된 범위에서 반응을 인지하여 SSC, FL 등을 인지한다.

 

이제 photodetector에 빛이 도착하면 그 전류에 의해 Pulse가 생성된다.

 

이 pulse의 진폭은 photodetector에 도착하는 photon의 수에 비례하고,

 

pulse의 모양은 입자의 크기와 속도, beam 에 비춰지는 입자의 너비, 형광색소의 종류, 입자 내 존재하는

 

형광 염색소에 따라 결정된다.

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이렇게 일련의 과정을 거치면 내가 원하는 수치화된 데이터를 얻을 수 있다!

 

다음으로는 내가 실험을 어떻게 하고 있는지 실제 실험방법에 대해 알아보도록 하자!

 

 

참고 : m.blog.naver.com/PostList.nhn?blogId=hyouncho2