[실험] Flow cytometry / FACS / 유세포 분석 - ③ 실험 꿀 TIP!!!

 

 

이전 포스팅을 통해서 내가 FACS를 측정할 때 어떤 장비를 쓰는지, 어떻게 유지보수를 하고 있는지를 기술하였고,

 

이번에는 내가 측정하기 위해서 샘플을 어떻게 준비하는지 알아보도록 하자!

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출처_https://neogenomics.com/pharma-services/lab-services/flow-cytometry

 

샘플 준비과정은 정말 엄청 간단하다.

 

세포가 배지에 부유되어 있을 때

 

일정량을 harvest해서 FACS buffer로 cell debris와 media를 wash 한 다음,

 

antibody를 넣고 4°C에서 cell과 반응시킨 후,

 

다시 FACS buffer로  반응되지 않은 antibody나 잔여물들을 wash 하고

 

FACS buffer에 부유시킨 후 장비로 측정하면 된다.

 

 

단계단계는 정말 쉽다. 모든 랩실에서 각자만의 레시피와 방법들을 다 갖추고 있기 때문에

 

이 과정에 대해서는 자세히 기술하지 않고,

 

나는 내가 어떻게도 측정해봤는데 잘 되더라!

 

아니면 이렇게 해봤더니 잘 안되더라! 이런 내용을 담아보도록 하겠다.

 

원래 이런게 실험인들끼리의 팁 공유 아니겠습니까????? 예?????????? ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ 🤣🤣🤣🤣

 

이 포스팅을 읽고 계신 생물인 여러분!!!

 

여러분들도 가지고 계신 꿀팁들 좀 나눠주셔요! ㅋㅋㅋㅋ

 

 

물론 별거 아닐 수도 있지만

 

처음 해보는 사람들은 당황하거나 실험망쳤다고도 생각할 수 있기 때문에..

 

ㅋㅋㅋㅋㅋㅋㅋ

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1. antibody 염색은 10분만 해도 잘 된다.

 

기본적으로 모든 랩실에서 적어도 30분 이상은 염색시키라고 한다.

 

만약 염색이 잘 안됐다.. 측정이 잘 안된다.. 그럴 때 선배 연구원한테 잘 안 된다고 말하면

 

좀 더 오래 염색해봐 이런 사람들 있을 수 있는데

 

염색 될거는 10분만 해도 정말 정말 잘 염색된다.

 

30분 해서 안된 염색이 1시간 해서 잘 될 일은 ... 글쎄......

 

나는 없다고 생각한다.

 

2. 준비한 cell이 많다고 다 좋은게 아니다.

 

한 샘플가지고 여러개 붙인다면 그만큼 세포를 많이 준비하는건 당연하다.

 

예를 들어서, (CD19-FITC/CD20-APC/CD10-PE)를 붙이고,

 

(CD2-FITC/CD3-APC/CD7-PE)를 붙여야 한다면

 

물론 세포를 그만큼 두배 준비해야겠지만

 

세포 많으면 많을수록 좋겠지! 해서 무작정 세포 많이 준비해버리면

 

그만큼 붙일 antibody도 많이 넣어줘야 하고,

 

끝에 장비에 넣어서 빨아올릴 때 너무 cell농도가 높아버리면

 

결정적으로 캐필러리가 막혀버릴 수 있다.ㅠㅠ 

 

그러니까 적정 수준의 농도로만, 장비가 권장하는 농도로만 세포를 준비하는 것이 좋다!

 

3. 세포를 FACS buffer로 고정시켜놓고, 하루 뒤에 측정해도 잘 나오는 애들은 정말 잘 나온다.

 

내가 한 번 장비가 고장나서 준비된 세포를 즉시 측정하지 못할 때가 있었는데,

 

그 때 냉장고에 넣어놓고 그 다음날 장비 수리가 끝난 후에 염색 했을 때

 

만족할 만한 결과를 얻었다.

 

물론 FACS buffer로 고정해놨을 때의 얘기다! 고정해놓지 않고 media에 띄워서 상온이나 냉장고에 그냥 방치 했다면

 

세포 다 죽어있을 가능성이 크다 ㅠㅠ ㅋㅋㅋ

 

4. FACS buffer로 고정된 친구, RNA isolation 잘 되더라...

 

내가 mRNA isolation을 위해서 샘플을 보내야 했었는데

 

세포가 너무 부족해서 FACS측정한 친구로 샘플을 보냈어야 했다.

 

그 때 FACS buffer에 한번 담겼던 친구를 centrifuge돌려서 wash 한 후

 

Trizol로 lysis해서 deep freezer에 넣어놓고 업체에 샘플 보냈었는데

 

QC결과 정말 잘 나왔다. ㅋㅋㅋㅋ

 

이 부분은 정말 나도 놀랬다!!! 안나올줄 알았는뎀

 

근데 다시는 이렇게 세포 부족한 경우는 없었으면 좋겠다 ㅠㅠ 

 

5. wash 과정은 한번씩만 해도 되지만, 제대로 wash 안 됐다면 결과에 큰 영향을 미친다.

 

이것은 정말 기본 중의 기본이지만

 

실험하다보면 wash 과정.. 정말 귀찮을 때가 있다.

 

특히 샘플 개수가 많아버리면 centrifuge column개수 넘어가니까

 

한번 wash 과정에서도 centrifuge를 두세번 돌려야할 때가 있고

 

그러면 시간 엇갈려버리고.. 정말 귀찮아져서

 

그냥 한번씩만 하자.. 이렇게 나 스스로 타협할 때가 있는데

 

그러다가 wash 잘못 되서 결과 이상하게 나오면 전부 내 책임이다. ㅠㅠ

 

그러니까 wash 과정은 철저히 잘 할 것!!!!

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이렇게 나만의 flow cytometry 꿀팁 아닌 꿀팁?들을 정리해보았다.

 

댓글로 여러 연구원분들의 꿀팁도 듣고 싶다! 

 

언젠가 내 블로그가 잘 커서 많은 연구원분들과 소통의 장이 되었으면 좋겠다아!!!