[실험] Apoptosis assay - In situ Direct DNA fragmentation assay (TUNEL assay)

인체의 정상조직은 세포증식과 세포 사멸 사이의 균형으로 항상성을 유지하고 있고

 

다양한 원인에 의하여 세포 증식이 활성화되거나 세포사가 감소하면

 

세포의 수가 비정상적으로 증가하여 종양을 형성하게 된다.

 

 

즉, 종양의 성장은 세포생산과 세포죽음 사이의 불균형으로 인해 생긴 결과라고 말할 수 있다.

 

이처럼 세포 생존 주기는 인간이 정상적인 유기체를 유지하는데에 정말 중요한 영향을 미친다.

 

그래서, 실험할 때 세포가 죽었는지 살았는지, 죽어가는 단계 중에서도 어떤 단계인지를 확인하는 실험들이 많이 있다.

parameters of apoptosis 출처_DAWINbio

이렇게 세포 주기를 확인하기 위해 여러 파라미터들이 있다!!

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세포가 죽을 때는 apoptosis를 거치게 되는데, apoptosis는 세포사(死)의 한 형태로

 

외부 인자의 자극이나 내적인 변화에 의해 세포사경로가 활성화되어 세포를 제거하는 선택적인 과정이다.

 

Apoptosis 가 이루어지고 있는 세포는 몇 시간 동안 그 상태가 진행되고

 

그 주위에 있는 대식세포 등에 의해 탐식되어 리소솜에 의해 분해된다.

 

Apoptosis가 이루어지고 있는지를 확인하기 위해서는

 

In situ Direct DNA fragmentation assay (TUNEL assay) 방법으로,

 

DNA fragment가 생긴 것을 보고 apoptosis의 진행을 증명할 수 있다.

출처_abbkine

In situ Direct DNA fragmentation assay (TUNEL) 는 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)라는 효소를 이용해서

 

UTP(uridine triphosphaste)가 DNA fragment terminal에 붙어서

 

그 DNA가 fragmentation이 일어났는지 여부를 파악하는 실험방법이다.

 

DNA fragmentation이 일어나면 2중 나선구조를 가지고 있는 DNA 구조에 분열이 생기고, N terminal이 노출되게 되는데

 

그 N terminal에서 붙은 UTP의 형광이 발광하는 것을 확인하는 assay다.

 

살아있는 세포에는 TUNEL을 염색해도 아예 발광하지 않지만

Live cell. TUNEL 염색 안 된 모습!!! 출처_네이버블로그, Dr.Jin's Lab

죽은 세포는 TUNEL을 염색했을 때 보이는 것처럼 형광이 확인된다.

Apoptosis cell. TUNEL 염색 된 모습!!! 출처_네이버블로그, Dr.Jin's Lab

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이 실험이 궁금해서 abcam 에서 판매하고 있는 키트의 프로토콜을 봤는데

 

키트에 positive control을 확인할 수 있는 cell과 negative control을 확인할 수 있는 cell도 포함되어 있다!!! 신기방기

 

세포가 어떻게 오는거징

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TUNEL Assay Kit - FITC (cat NO : ab66108) protocol의 summary를 해보면 아래와 같다.

(광고 아님!!! abcam 광고 받고싶습니당 ㅋㅋㅋㅋㅋ)

 

1.     얼음 위에서 15분간 formaldehyde를 이용해서 cell fixing

 

2.     PBS로 cell wash

 

3.     얼음처럼 차가운 70% ethanol 을 넣어서 30분간 incubation

 

4.     Centrifuge 후 cell pellet을 다시 Wash buffer로 풀어준 후에 다시 wash

 

5.     Cell pellet을 staining solution에 풀어준 후에 37℃에서 60분 incubation

 

6.     Rinse buffer를 첨가한 후에 centrifuge 후 상등액을 버리고 다시 rinse

 

7.     Cell pellet을 propidium iodide/RNAse Asolution에 풀어준 후 room temp으로 30분 incubation

 

8.     Flow cytometer 또는 fluorescence microscope으로 analysis

 

이 키트는 아래처럼 다양한 세포 타입에 적용된 레퍼런스가 있다고 한다.

출처_abcam

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하지만 In situ Direct DNA fragmentation assay (TUNEL) 의 단점은 apoptosis와 necrosis를 구분할 수 없다는 것이다.

 

Apoptosis는 세포가 스스로 죽는 자연사, 세포사멸이고,

 

necrosis는 손상을 입거나 염증이 생겨서 조직이 파손되어 세포가 죽는 괴사, 세포의 사고사다.

 

그러니까 스스로 죽는 친구인지, 아니면 어떤 원인에 의해 죽는 친구들을 구분할 수가 없다.

 

그래서 In situ Direct DNA fragmentation assay (TUNEL) 하나만 가지고는 세포죽음을 완벽하게 구분할 수는 없으므로

 

여러 실험을 같이 해서 부족한 부분을 채운다.

 

다른 실험들도 공부해서 또 가지고 오도록 하겠다!!!!!