[실험] quantitative PCR, Real time PCR(qPCR, RT-PCR) 원리와 분석방법은??

오늘 뽑아놓은 cDNA 로 quantitative PCR , qPCR 을 돌렸다!!!

 

내 cell에 있는 RNA, 그러니까 protein으로 발현하기 전 RNA를 extraction했고,

 

이걸로 cDNA를 합성한 후에 정량값을 비교하기 위해 qPCR을 진행했다!

 

근데 사실 나는 qPCR, 그러니까 정량값을 계산해본적이 없다.

 

그냥 cDNA를 합성해서 gel을 내려서 그 발광도만 육안평가하고

 

내가 디자인 한 PCR product대로 사이즈가 잘 나오는지를 확인해보았기 때문에

 

RTPCR을 평가하고 분석하는 방법은 잘 모른다.

 

이 기회에 한번 공부를 해보기로 했다!!!!!

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RT-PCR. 출처_https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/real-time-polymerase-chain-reaction

qPCR은 quantitative Real time PCR (qRT-PCR) 또는 real time PCR이라고도 불린다.

 

이 실험 기법은 mRNA의 발현량이 어느정도인가를 확인하는 실험이다.

 

real time PCR은 RT-PCR이라고도 불리는데, 

 

실험자들이 종종 이 실험을 Reverse transcription PCR(RT-PCR)이랑 헷갈리는 오류를 범하기도 한다.

 

reverse transcription PCR은 mRNA를 cDNA로 역전사효소를 이용해서 거꾸로 합성하는 방법이다.

 

mRNA는 굉장히 불안정하기 때문에 cDNA로 합성해서 보관한다.

 

 

RT-PCR은 각 유전자의 정확한 정량을 위해서 실시간으로 생겨나는 형광을 검출하는 분석법이다.

 

이 중 가장 대표적인 것은 SYBR Green(사이버그린) 을 이용한 검출법과,

 

TagMan probe를 이용한 Probe방식이 있다.

 

SYBR Green 방법은

 

PCR product가 생겨나면서, 그러니까 3'에서 5'로 PCR이 진행되면서

 

그 사이에 형광 dye가 들어가면서 빛을 발하게 되는데 그 형광을 검출하는 방법이고,

출처_https://blog.naver.com/kdrbiotech/110312772

 

TagMan probe 방법은

 

5'end 에는 형광물질이 붙고, 3'end 에는 quencher dye를 합성시켜서 FRET 현상을 일으켜 이를 검출하는 방법이다.

 

FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer)란

 

Quencher dye가 가까이에 있으면 형광물질이 exceited 되는 동안에 에너지를 내지 못하게 되는 현상을 말하고,

 

일정 거리 이상이 되면 quencher dye에 의한 quenching 현상이 일어나지 못하게 되어 에너지를 내고

 

(quenching 이란?  빛이 줄어드는 현상을 말한다.

 

물질간 교환과정 (intermolecular photo-physical process)을 통해서 나타나는 소광현상이다.)

 

이때를 검출하여 PCR product를 측정할 수 있는 것이다.

출처_https://blog.naver.com/kdrbiotech/110312772

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그러면, SYBR Green 방법과 TagMan Probe 방법은 어떤 차이가 있을까?

 

1. sensitivity & Specificity

 

SYBR Green 의 경우에는 DNA에 결합해서 발광하는 방법이기 때문에 TagMan Probe 보다 sensitiviy, specificity가 낮다.

 

2. Multiplexing

 

Probe 방식은 형광 dye를 여러가지 사용할 수 있지만 SYBR Green 은 한 가지만 사용할 수 있으므로 multiplexing 방법이 불가능하다.

 

 3. Melting curve analysis

 

melting curve 는 PCR이 다 끝난 후에 온도를 서서히 올려서 형광 세기를 모니터링 하는 것이다.

 

온도가 올라가면서 double strand DNA 가 single 로 될 때, 형광 세기는 급격하게 감소하고,

 

이 때의 온도를 Tm 값이라 하며 PCR product 의 고유 값이다.

 

melting curve 로 non-specific product, primer dimer, primer pair 등을 확인할 수 있고

 

더 나아가서 SNP에서도 이용이 가능하다.

 

melting curve는 SYBR Green 방법, primer 방법에서는 가능하나

 

probe 방식은 probe가 이미 tag의 5' exonuclease activity에 의해 분해되었기 때문에 melting curve가 불가능하다.

출처_https://blog.naver.com/kdrbiotech/110312772

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melting curve analysis 시에 원하지 않는 peak이 확인 된다면 아래의 두가지를 의심해보고 해결한다.

 

1. genomic DNA 유래의 PCR product or cDNA variants 일 가능성

 

이 때에는 primer를 다시 제작한다. exon을 겹치게 해서 design하면 이 문제를 해결하기 쉽다.

 

(근데 내가 primer blast에서 해봤을 때 no primer 라고 뜨던데.. 이건 어떻게 하는거지.. 내가 잘 모르는 걸수도 ㅠㅠㅠ 공부엔 끝이 없다 ㅠㅠㅠㅠㅠ 아우)

 

2. primer dimer가 나오거나 low Tm 을 가지는 PCR product

 

이때에는 primer 농도를 낮추거나 annealing time을 낮춘다.

 

그리고, qPCR시 no template control의 data를 보고 문제점을 찾아낼 수 있다고 한다.

 

출처_https://blog.naver.com/kdrbiotech/110313293

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내 샘플은 아직 분석은 아니고 primer test 중이다.

 

house keeping gene 2쌍(GAPDH, actin)이랑 다른 specific primer 3쌍을 primer test를 했는데

 

GAPDH가 꽝이 나버렸다.

 

ㅠㅠ

 

내가 디자인 해서 주문한건데...

 

일단 다시 디자인 해보고 재도전해보려고 한다!!!!

 

실험 성공할때까지!!! 홧팅!!!!!!!