[실험] Western blot을 해보자!! - ① buffer 준비 및 set up

내가 있었던 랩에서는 주로 Cell work과 DNA work이 루틴웍이였어서

 

Protein 발현량 확인 같은 것도 qPCR로 다 했지 

 

western blot 으로는 해보지 않았다.

 

 

다들 그렇겠지만 처음 해보는 실험은

 

막연한 두려움이 생기기 마련이다.

 

특히 western blot은 한 번 실험을 시작하면

 

셀 키우는 시간부터 샘플링, 확인하는 시간까지

 

거의 일주일 정도가 소요되기 때문에

 

한 번 실험을 망치면 일주일을 날려버려서 더욱 두려움이 있었다.

 

(정확히 western blot만을 위해서는 2일이 소요된다.)

 

호흡이 긴 실험인 만큼 관련 내용의 포스팅도 길어질 것 같다 ㅠㅠ 

 

그래도 꼼꼼히 기록해놓고 나중에 잊어버리지 말아야지!!

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먼저 Western blot의 원리를 알아보자.

 

이 실험은 내가 원하는 protein과 반응하는 antibody를 이용해서

 

확인하고자 하는 protein을 찾아내는 실험이다.

 

전기영동으로 gel 상에서 먼저 크기에 따라서 분리를 한 다음,

 

분리된 protein을 PVDF membrane으로 transfer한다.

 

그 다음 그 protein에 붙는 antibody를 1차로 반응시켜서 붙인 다음

 

발광형광으로 2차반응 후 케미닥으로 확인한다.

 

이러한 일련의 실험 과정이 약 이틀정도 소요되는 것이다.

 

 

추가적으로,

 

Southern blot은 DNA detection,

 

Northern blot은 RNA detection을 말한다.

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실험을 개시해보자!!!

 

 

출처_Biorad

 

먼저 western blot에 필요한 기기를 구비한다.

 

western blot tank, gel 제작틀(집게틀, 클리퍼(이름이 맞나?), 유리틀, comb),

 

트랜스퍼를 위한 틀, 파워,,,, 등등이 있다.

 

그리고 명함틀을 많이 준비한다.

 

membrane 옮긴 후에 antibody 붙일 때 

 

명함틀 정말 유용하게 많이 쓰인다. 구멍이 없는걸로!!

 

버퍼 새니까 ㅎㅎㅎㅎ

 

그리고 membrane 자리 나눌만한 테이프도 구비한다.

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셋팅이 완료되면 시약을 제조한다.

 

기본적으로 Running buffer (SDS buffer), Transfer buffer, TBS-T, skim milk 등이 있다.

 

먼저 Running buffer는 

 

DW : 10x Tris-glycine buffer 의 비율을

9 : 1 로 섞어서 상온 보관한다.

이 런닝버퍼는 여러번 재사용해도 되는데

샘플때문에 버퍼가 조금 파란 빛을 띠면 새로 갈아준다!

 

그 다음 Transfer buffer는

 
DW : methanol : 10 x transfer buffer 를

7 : 2 : 1 의 비율로 섞어준다.

이 transfer buffer는 냉장보관하고

재사용이 가능하다.

TBS-T buffer 의 경우에는

DW : 10x TBST buffer 를

9 : 1 비율로 섞어서 쓴다.

상온보관하고, 얘는 washing buffer 기 때문에 일회용이라

자주 만들어줘야한다!

 

마지막으로 skim milk !!

 
0.5% skim milk를 TBST buffer로 만드는데

나는 2.5g skim milk 파우더에 50ml TBST buffer 넣어준다.

코니칼튜브가 50ml 짜리가 있으므로.. ㅋㅋㅋㅋ

얘는 탈지분유라서 잘 상하니까 냉장보관하고 1주일 내에 소진하는게 좋다.

추가적으로 BSA buffer 도 있는데

이거는 3%로 만들면 되고 얘도 TBS T로 만든다.

 

이렇게 제조하면 필요한 시약은 거의 다 만들어 놓은 셈이다.

 

buffer, 심지어 위험한 메탄올도 사용되니까

 

실험 시 장갑과 마스크 착용을 꼭 하도록 한다.

 

그리고 1L 짜리 bottle도 넉넉히 준비한다.

 

하다보면 wash 과정이 많은데 이 때 버려지는 waste도 무시하지 못하니까!

 

이 정도 하면 western blot을 위한 기본 셋팅은 완료되었다.

 

다음에는 gel 제작과 sample 제작에 대해서 알아보도록 하자!