[실험] western blot을 해보자!! - ② gel 및 sample 제작

앞선 포스팅에서 실험 셋팅을 완료했으니

 

이제 실험을 본격적으로 시작해보자.

 

gel 제작부터 먼저 배워보자.

 

gel은 만들어놓고 마르지 않게 냉장보관해주면

 

1주일 정도는 보관 가능하다.

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출처_creative-diagnostics.com

먼저 알코올로 gel 유리틀을 잘 닦아 준다.

 

gel 유리틀은 두 장으로 되어있는데,

 

하나가 길고 하나가 짧다.

 

두 개를 겹쳤을 때 안 쪽에 어느 정도 공간이 생기는 부분이 있는데,

 

 그 곳에 gel을 부어 굳혀서 사용한다.

 

유리를 겹쳐서 수평을 잘 맞춘 다음

 

위에 보이는 초록색 클리퍼로 단단히 고정한다.

 

그 다음 집게틀에 꽂아서 고정하는데,

 

gel을 부었을 때 새면 안 되기 때문에 물을 부어 새는지 안 새는지 확인한다.

 

집게틀에 꽂은 다음 물을 부어놓고 gel을 위한 buffer를 제작한다.

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gel 에 들어가는 조성물은 다음과 같다.

 

30% Acrylamide / APS / DW / 1.5 Tris / SDS / TEMED

 

이렇게 총 여섯가지 시약이 필요하다.

 

gel 레시피는 굉장히 유명한 아래의 표를 따른다.

western blot 하는 사람들 실험대에 필수적으로 붙어있움 ㅋㅋㅋㅋㅋ

Western blot에 이용되는 gel은 두 가지의 gel이 층을 이루게끔 만든다.

아래에 깔리는 gel 은 Running gel로

작은 pore를 가지는 polyacrylamide gel이다.

 

Running gel 은 acrylamide 농도가 stacking gel 보다는 높아서

 

단백질이 분자량에 따라서 이동속도 차이를 보인다.

 

stacking gel은 running gel위에 깔리는데, 

 

acrylamide 농도가 낮아서 단백질 이동속도가 빨라 거의 동일한 속도로 내려온다.

 

그래서 모든 단백질들이 running gel에 들어가기 전에

 

같은 출발선상에 동일하게 위치할 수 있게 되는 것이다.

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Running gel 부터 만들건데,

 

보고자하는 protein 크기에 따라서 gel 퍼센테이지 골라서 만든다.

 

작으면 작을수록 gel 퍼센트가 낮아진다.

 

빨리 숙숙 내려와야 하니까!!

 

유리틀 안에 Running gel은 8ml 정도 들어가는데,

 

10ml를 만들어서 2ml를 남겨 굳기를 확인하는 용도로 쓴다.

 

레시피에 적혀있는 버퍼를 위에서 아래의 순서대로 넣어준다.

 

물-Acrylamide-Tris-SDS-APS-TEMED

 

TEMED가 gel을 굳게하므로 마지막에 넣어준다.

 

이 친구를 넣으면 이제 gel에서 열이 생기면서 서서히 굳기 시작한다.

 

이렇게 gel을 제작할 때 까지 아까 부어놨던 물이 새지 않았으면 

 

고정이 잘 된 것이므로 물을 버린 후에 종이로 물을 잘 흡수시켜 준 후

 

pipetaid를 이용해서 gel buffer를 부어준다.

 

Running gel buffer를 붓고 isopropanol을 부어서 gel이 평평한 상태로 만들어지도록 한다.

 

넘치지 않도록만 부어주면 된다!

 

꼭 isopropanol이 아니어도 된다.

 

Acrylamide gel 의 분자량보다 가볍기만 하면 된다!!

 

 

그 다음 Stacking gel을 만든다.

 

이 친구도 똑같이 위의 레시피를 따르면 된다.

 

stacking gel 만들 때 아까 만들어놨다가 남겼던 gel이 굳었으면 

 

isopropanol위로 stacking gel을 붓고

 

샘플 수에 맞게 comb을 꽂아서 굳힌다.

 

isopropanol은 acrylamide gel 보다 분자량이 작기 때문에 알아서 넘치긴 하지만

 

그래도 혹시 모르니까 잘 털어내서 버린 다음

 

DW로 wash한 다음 stacking gel을 넣고 comb 을 꽂는다.

 

이렇게 5분정도 기다리면 gel 완성!!!!

 

이제 샘플 넣고 시작하자!!!!!

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만약 여기서 바로 실험을 시작하지 않고 gel을 보관하려고 하면

 

먼저 호일을 뜯어서 바닥에 깐 다음 티슈를 한 장 올리고

 

물을 적절히 도포해서 티슈가 촉촉해지도록 한다.

 

여기에 클리퍼를 제거한 유리틀 그대로 (comb도 안 뺌!!)

 

올린 다음 티슈와 호일로 꼼꼼히 감싸서 gel이 마르지 않도록 해주고

 

호일 바깥 쪽에 만든 날짜 / gel % / 만든 사람 이름을 적어서 냉장보관하도록 한다.

 

이대로 일주일 보관 가능!!

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이제 gel을 만들었으니 sample 제작법에 대해서 알아보도록 하자!!!

 

일단 배양한 세포를 lysis 해야한다.

 

세포막을 터트려서 가지고 있는 단백질을 뱉어내게끔 하는 것이다.

 

먼저 lysis buffer를 제작해야 한다.

 

RIPA buffer / phophatase inhibitor / protease inhibitor를 사용한다.

 

제작법에 맞춰서 잘 만든 후 

 

하나의 샘플 당 약 100~200ul 씩 넣어서 scrapper로 빡빡 긁어준다.

 

pipetting을 열심히 해서 또 잘 터지도록 한다.

 

이 친구들을 튜브에 잘 모아서 100℃에서 8분 끓이고

 

바로 ice에서 식혀준다.

 

그 다음 centrifuge한 후 상등액을 사용한다.

 

이 상등액으로 BCA assay를 통해 단백질 양을 측정한다음

 

sample / 5X SDS PAGE / RIPA buffer 

 

이 세가지로 토탈 20ul 를 맞춰서 만들어준다.

 

20ul는 10comb 기준이므로 17comb 사용자들은 알아서 조절하시길!!

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이렇게 gel 도 만들고 sample도 만들었으니

 

이제 Running 만 남았다!!!! 

 

sample 제작과 gel 제작 만 해도 오전은 후딱 지나간다.

 

tank를 조립하고 Running buffer를 부어준 후에

 

sample loading 하고 Running 하면 끝!!

 

내려오는 gel에 따라서 voltage를 조절해준다.

 

약 1~2시간 정도 내리면 내가 원하는 단백질이 어느 정도 분리 되어있을 것이다!!

 

이 후에 membrane으로 Transfer 하는 방법을 알아보자!!