[실험] ICC, Immunocytochemistry, 세포면역화학염색법에 대해 알아보자!

Immunocytochemistry, 세포면역화학법에 대해서 알아보자.

 

Immunocytochemistry는 ICC라고도 불리고, 결합하는 특정 1차 항체를 가지고

 

세포에서 특정 단백질, 항원을 해부학적으로 시각화하는데 사용되는

 

일반적인 실험법이다.

 

ICC를 통해서 특정 샘플의 세포가 보고자 하는 단백질을 발현하는지를 평가할 수 있다.

 

그러니까, 세포로 하는 Western blot이란 말씀!

출처_위키백과

 

---

Immunocytochemistry는 나도 한 번도 해보지 않은 실험법이다.

 

이번에 하는 방법을 배웠는데, 정리할 겸 이렇게 포스팅을 하게 되었다.

 

글로 한 번 정리를 하면 나도 기억에 오래 남기도 하고 ㅋㅋㅋㅋ

 

조금 엉성할 수 있지만 혹시 추가해야 할 부분은 

 

댓글로 알려주시면 감사하겠습니다! ㅋㅋㅋㅋ

---

우선 이 실험은 cell을 seeding 하고 키우는 단계를 제외하고는

 

전부 shaker 위에서 진행한다!

 

먼저 12well이나 24well, 아니면 ICC를 위해 개발된 plate 등에서 cell을 키운다.

 

잘 배양된 세포가 준비되면

 

크던 배양액을 제거한다.

 

배양액을 버리고 세포를 PBS로 2번 wash 하는데, Shaker 위에서 5분동안 두면 된다.

 

그 다음, 4% 파라포름알데히드를 이용해서 고정한다.

 

파라포름 알데히드는 12well기준 한 well당 100ul 정도 들어간다.

 

상온에서 30분에서 1시간 정도 고정해준다.

 

이렇게 하면 세포가 고정된다!

 

1시간 정도 흐르면 4% 파라포름알데히드를 버리고 

 

PBS를 이용해서 또 2번 wash 해준다.

 

그 다음, PBS를 이용해서 0.01% Triton 을 만들어서 

 

12well 기준, 한 well에 200~300ul 정도 넣고

 

상온에서 3분간 반응시켜 준다.

 

3분이 끝나면 바로 Triton을 버리고 PBS로 또 2번 wash 해준다.

 

그 다음 바로 blocking 을 하는데

 

PBS로 만든 3% BSA를 이용해서 상온에서 1시간 반응시킨다.

 

1시간동안 blocking 이 끝나면 BSA를 버리고

 

3% BSA에 보고자하는 단백질의 antibody를 맞는 비율로 희석해서

 

세포가 전부 적셔질 수 있을 만큼 부어서 냉장상태로

 

쉐이커위에서 하루 둔다! 오버나잇 반응!

---

다음 날에 2차 항체를 붙인다.

 

2차항체도 마찬가지로 3% BSA에 만들고, 1차 항체의 host에 맞게 선택해서 붙여준다.

 

2차 항체의 희석 비율은 무조건 1:200!!!

 

2차 항체를 부어준 다음에는 호일로 감싸서 상온, 쉐이커 위에서 1시간 반응시킨다.

 

1시간 후에는 또 PBS wash 3번 진행한다.

 

그 다음 DAPI를 붙여준다. DAPI는 DNA에 결합하는 형광염색이다!

 

다피는 멸균되지 않은 3차 증류수로 희석해서 사용해도 된다.

 

다피를 붙이고 3분간 상온에서 반응한다!!

 

3분이 지나면 PBS로 1번 wash하고 DW로 1번 wash 해서 mounting용액으로 mounting 하고 

 

바로 형광현미경으로 측정하면 끝!!!!!!

---

사실 나는 단백질이 발현되면 GFP가 발현해서 세포가 바로 발광하는 세포만 썼어서

 

이렇게 직접 염색하는 실험은 안 해봤다.

 

해봐도 DAPI 붙이는 AP실험 정도....

 

그래도 새로운 실험은 언제 배워도 재미있고 신기하고

 

이번에 배우면서 정확히 익혀두면

 

나중에 더 실력있는 실험자가 되지 않을까 싶다!!

 

열심히 배워놔야지 ㅎㅎㅎㅎㅎ